CMDE遗传性耳聋基因检测试剂盒技术

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体外诊断试剂产品注册技术审评报告

产品中文名称：遗传性耳聋基因检测试剂盒（联合探针锚定聚测序法）

产品管理类别：第三类

申请人名称：华大生物科技（武汉）有限公司

国家药品监督管理局

医疗器械技术审评中心

基本信息

一、申请人名称

华大生物科技（武汉）有限公司

二、申请人住所

武汉市东湖新技术开发区高大道号武汉国家生物号产业基地项目B、C、D区研发楼区B2栋

三、生产地址

武汉市东湖新技术开发区高大道号武汉国家生物号产业基地项目B、C、D区研发楼区B2栋五楼B1栋一楼

产品审评摘要

一、产品概述（一）产品主要组成成分

表1试剂盒主要组成成分

试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。（二）产品预期用途本试剂盒用于体外定性检测干血片样本中人基因组DNA的4个遗传性耳聋基因的20个位点的突变（见表2），检测结果用于耳聋的辅助诊断，本产品用于构建测序文库。检测结果仅代表对相关位点的检测，不作为患者是否有遗传性耳聋倾向的诊断和排除的唯一标准，如需确诊病例，请结合临床症状及其他检测手段进行综合评估。表2试剂盒检测的遗传性耳聋基因20个突变位点信息（三）产品包装规格人份/盒，人份/盒（四）产品检验原理本试剂盒采用联合探针锚定聚合测序法，根据遗传性耳聋基因突变位点序列信息设计特异性扩增引物，利用多重PCR技术扩增人基因组DNA中的靶序列并同时引入用于样本识别的样本标签序列。将多个（≤96个）样本的PCR产物按比例混合成为一个文库样本，经过一系列文库制备过程，每个文库样本中的DNA序列都加上了用于测序及文库识别的接头序列。将适量文库样本按等物质的量比例混合为一个测序样本。基因测序仪对测序样本进行序列信息读取，经过文库接头序列及样本标签序列比对拆分，测序样本中每一条DNA的测序结果将被精确定位到每一个样本中。将每个样本的测序结果与人类基因组比对并对4个耳聋基因的20个突变位点进行数据分析，从而确定20个位点的检测结果。二、临床前研究摘要（一）主要原材料1.主要原材料的选择试剂盒主要原材料包括：PCR扩增引物、标签接头、文库扩增引物、PCR扩增液、T4多聚核苷酸磷酸激酶、连接酶、PCR反应液、磁珠、“炎黄1号”基因组DNA样本、野生型质粒和纯合突变型质粒等。野生型质粒和纯合突变型质粒由申请人设计并生产，其他主要原材料均为外购方式获得。PCR扩增引物、标签接头和文库扩增引物为申请人自行设计后由专业的合成公司合成。申请人选择有资质的供应商提供原料，通过功能性试验筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。2.企业参考品和质控品设置情况企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品和最低检测限参考品。阳性参考品9份，涵盖该产品可检出的所有突变类型。其中，6份由多种突变类型的重组质粒组成，3份由含有非稀有突变的临床样本组成；阴性参考品3份，由该试剂盒检测范围内变异阴性的临床样本组成；最低检测限参考品12份，涵盖该产品可检出的所有突变类型。其中，9份由阳性参考品稀释而成，3份由阴性参考品稀释而成。试剂盒包含2份阳性对照品和1份阴性对照品，用于检测过程的质量控制。其中，阳性对照品由重组质粒组成，阴性对照品由“炎黄1号”基因组DNA组成。（二）生产工艺及反应体系研究申请人通过使用初步确定的配方进行反应体系配置，对反应体系中的PCR反应引物用量、PCR反应引物配比、文库制备起始量、磷酸化酶用量、连接酶用量、标签接头用量、文库扩增体积、PCR反应液用量、文库扩增引物用量、磁珠用量、文库扩增反应条件等进行筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最佳的反应体系。（三）分析性能评估分析性能评估内容包括核酸提取试剂性能、不同装量试剂盒性能、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、重复性、批间差、最低检测限、分析特异性以及与Sanger测序法检测结果比较等。针对核酸提取试剂性能研究，申请人采用临床样本平行比较了“核酸纯化试剂”和“核酸提取试剂”的提取性能，并根据与该产品的组合性能研究结果，确定“核酸纯化试剂”和“核酸提取试剂”符合检测要求，推荐上述试剂为样本提取用试剂。针对不同装量试剂盒性能研究，申请人采用临床样本平行比较了两种不同装量试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总符合率。结果显示两种装量试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为%，证明两种装量试剂盒之间无性能差异。阳性参考品符合率评估中，申请人分别在三种适配机型（基因测序仪（BGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-0））上使用连续生产的三批试剂盒对9份企业阳性参考品进行检测，检测结果显示阳性参考品符合率均为%。阴性参考品符合率评估中，申请人分别在三种适配机型（基因测序仪（BGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-0））上使用连续生产的三批试剂盒对3份企业阴性参考品进行检测，检测结果显示阴性参考品符合率均为%。重复性和批间差评估中，申请人分别在三种适配机型（基因测序仪（BGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-0））上使用连续生产的三批试剂盒对3份企业阳性参考品和1份企业阴性参考品进行10次重复检测，检测结果表明重复性和批间差均满足技术要求规定的性能指标要求。最低检测限评估中，申请人设置了四个浓度梯度的人基因组DNA，并对每个浓度的DNA样本进行了3次重复检测，将具有%检出率的最低浓度设定为预估检测限。在预估检测限浓度附近设置间隔更小的三个浓度梯度，并对每个浓度的DNA样本进行20次重复检测，将具有%检出率的最低浓度水平确定为最低检测限。申请人使用连续生产的三批试剂盒对稀释至最低检测限浓度水平的9份企业阳性参考品和3份企业阴性参考品进行检测，检测结果显示检出率、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率均为%。分析特异性评估中，申请人使用试剂盒对分别加入了不同梯度潜在干扰物质（血红素、甘油三酯和胆红素）的干扰样本在三种适配机型（基因测序仪（BGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-0））上分别进行检测。结果显示当样本中血红素浓度≤g/L、甘油三酯浓度≤0mg/dL、胆红素浓度≤2mg/dL时，试剂盒检测性能不受影响。申请人使用试剂盒对分别加入了特定浓度（约合质量浓度0.01ng/μL）的潜在非人类基因组核酸干扰物质（大肠埃希氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、白色念珠菌核酸）的干扰样本在适配机型（基因测序仪（BGISEQ-））上进行检测。结果显示样本中存在该浓度的大肠埃希氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、白色念珠菌核酸时，试剂盒检测性能不受影响。申请人使用试剂盒对存在检测范围外突变的临床样本在适配机型（基因测序仪（BGISEQ-））上进行检测。结果显示样本存在检测范围外突变时，试剂盒检测性能不受影响。以上检测结果表明试剂盒具有较好的分析特异性。与Sanger测序法检测结果比较研究中，申请人使用试剂盒对已知Sanger测序检测结果的临床样本在三种适配机型（基因测序仪（BGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-）、基因测序仪（MGISEQ-0））上分别进行检测。检测结果显示试剂盒检测范围内各突变位点的灵敏度、特异性和总符合率均为%。（四）阳性判断值对于13个单碱基替换型突变位点（GJB3基因的CT、GA突变；SLC26A4基因上的IVS7-2AG、AG、AT、CT、GA、GC、TA、CT、CT、GA、IVS15+5GA突变），采用贝叶斯定理计算分析直接得出突变类型。对于4个碱基缺失型位点（GJB2基因的35delG、_del16、delC、_delAT）和3个线粒体单碱基替换型突变位点（线粒体12SrRNA基因的T＞C、CT、AG突变），申请人使用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，简称ROC曲线）通过已知检测结果的临床样本确定阳性判断值。为验证阳性判断值，申请人使用试剂盒对已知检测结果的临床样本进行检测。检测结果显示阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为%，该结果表明建立的阳性判断值能准确判断检测范围内的20个突变位点的突变状态。（五）稳定性研究为考察遗传性耳聋基因检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）在不同条件（如温度、反复冻融、开瓶和运输）下保存时主要性能指标随时间变化的规律，为试剂盒的包装、运输、使用和保存条件的确定和有效期的建立提供依据，申请人采用连续生产3批遗传性耳聋基因检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）进行稳定性研究，包括实时稳定性、冻融稳定性、开瓶稳定性和运输稳定性。研究结果表明：本试剂盒包装盒1置于-18℃以下保存，包装盒2置于2℃～8℃保存，有效期为12个月；本试剂盒开瓶后置于相应保存条件下保存3个月仍可有效检测；反复冻融3次仍可有效检测。试剂盒包装盒1在干冰保护下运输5天仍可有效检出，试剂盒包装盒2在冰袋保护下运输5天仍可有效检出。适用样本稳定性研究：为考察干血片样本长时间保存是否会影响试剂盒的检出性能，申请人采用生产的遗传性耳聋基因检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）进行适用样本的稳定性研究，最终确定干血片样本室温干燥条件下可保存3年。三、临床评价摘要申请人在医院、内蒙古自治区妇幼保健院、医院共三家临床试验机构开展了临床试验。临床试验采用考核试剂与Sanger测序法进行比较研究，验证考核试剂的临床有效性。考核试剂临床试验共入组例干血片样本，最终纳入统计分析的有效样本例。有效样本中共检出例阴性样本、例阳性样本。阳性样本中，57例样本同时存在2个位点的突变，2例样本同时存在3个位点的突变，1例样本同时存在4个位点的突变。各突变位点的阳性样本情况如下：35delG突变阳性2例、_del16突变阳性13例、delC突变阳性例、_delAT突变阳性47例、CT突变阳性6例、GA突变阳性3例、CT突变阳性6例、GA突变阳性4例、AT突变阳性12例、GA突变阳性5例、CT突变阳性1例、GC突变阳性5例、TA突变阳性6例、CT突变阳性3例、AG突变阳性36例、IVS7-2AG突变阳性例、IVS15+5GA突变阳性2例、TC突变阳性11例、CT突变阳性2例和AG突变阳性10例。与Sanger测序法比较研究的结果显示，考核试剂在检测范围内的20个突变位点的检测灵敏度均为%、特异性均为%、总符合率均为%；采用Kappa进行统计学分析，20个突变位点的Kappa值均为1。结果表明考核试剂与Sanger测序法具有良好的检测一致性。综上所述，该产品的临床试验对产品的临床性能进行了全面研究，临床试验结果基本符合临床应用要求。四、风险分析及说明书提示依据“YY/T-医疗器械风险管理对医疗器械的应用”标准，对该产品进行风险分析。（一）受益评估本试剂盒用于体外定性检测干血片样本中人基因组DNA的4个遗传性耳聋基因的20个位点的突变，检测结果用于耳聋的辅助诊断。近年来临床上采用的听力筛查与基因检测相结合的方法，有助于临床早期发现处于语前听力损失、迟发性或药物致聋型高危患者，并可通过及时干预与治疗降低耳聋高危人群的发病率。（二）风险评估该试剂盒检测结果会受到样本来源、样本采集过程、样本运输条件、样本预处理等样本因素的影响，同时也受到试验操作、试验环境等试验因素的影响，导致可能得到假阴性或假阳性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在风险及检测的局限性，详见产品说明书中。不符合该试剂盒说明书中的样本或不恰当的实验操作会导致检测失败或假阴/阳性结果，请严格按照产品说明书中及的要求操作和进行实验过程质控。该试剂盒在检测过程中涉及基因扩增，在非可控的实验室操作可能由于环境中气溶胶的存在导致结果不可靠，同时PCR操作过程中气溶胶的泄露可能会导致设备甚至实验室的污染。因此，请在可控的实验室进行检测操作，操作人员必须进行专业培训，严格按照说明书操作。该试剂盒为基于二代测序平台的多基因位点体外诊断产品，检测过程主要包括干血片样本的人基因组DNA提取、PCR扩增反应、磁珠纯化、文库制备、DNA测序反应及数据分析等步骤。为确保检测全流程的质量得到有效控制，在产品设计开发阶段对涉及的提取试剂、测序试剂，涉及的仪器，涉及的软件进行了全流程匹配性验证，为了确保检测结果的准确性，请使用该试剂盒推荐的配套试剂、仪器及软件进行检测。（三）受益-风险确定通过环境控制、生产监控、成品检验和增加说明书警示内容等防范措施，对该试剂盒的已知和可预见的安全风险进行控制和降低，剩余风险可以被控制在可接受范围内，同时没有带来新的危害与安全风险。在目前认知水平上，认为该试剂盒上市带来的受益大于风险。尽管目前认为该试剂盒的受益大于风险，但是为保证用械安全，基于对主要剩余风险的防控，已在该试剂盒说明书中提示以下信息：1.预期用途：本试剂盒用于体外定性检测干血片样本中人基因组DNA的4个遗传性耳聋基因的20个位点的突变，检测结果用于耳聋的辅助诊断。检测结果仅代表对相关位点的检测，不作为患者是否有遗传性耳聋倾向的诊断和排除的唯一标准，如需确诊病例，请结合临床症状及其他检测手段进行综合评估。2.警示及注意事项：该试剂盒说明书中明确了该试剂盒检验方法的局限性及使用中的注意事项。综合评价意见本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于优先审批项目。该产品为用于罕见病的体外诊断试剂，申请人的注册申报资料基本符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令年第5号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注册，但申请人需在该产品上市后进一步完成以下工作：鉴于耳聋基因的突变位点属于罕见病，申请人提交的临床试验资料虽然覆盖了全部位点，但个别位点例数偏少，经审评认为该产品满足目前临床使用要求，注册资料符合现行技术审评要求，为了进一步验证产品的检测性能，建议申请人在该产品上市后继续搜集10家临床机构使用该产品的检测数据结果在下一次延续注册时提交，搜集的数据应包括：1、临床应用数据；2、各基因位点杂合突变、纯合突变的例数。该项临床资料内容应当符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》中关于临床试验报告的要求，并由出具数据的各临床机构主管部门签章。

年04月16日

来源：CMDE

整理：致众TACRO

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