粤西部分地区耳聋患者耳聋基因检测结果分析

中华耳科学杂志,年18卷1期

粤西部分地区耳聋患者耳聋基因检测结果分析

梁少明李卫红郑恒保泽庆邹锦慧张绪鹏

根据世界卫生组织年数据，全球听力残疾人数为3.6亿，亚太地区是耳聋高发区之一[1]。年中国出生缺陷防治报告[2]显示，我国残疾人口中，先天性致残者约万，其中肢体残疾、听力残疾和智力残疾所占比例较大，分别为28.62%、24.97%和21.57%，可见耳聋已是最常见出生缺陷之一。我国人群中遗传性耳聋的发病率约为1/，每年新生2~3万聋儿，此外，还有相当比例的婴幼儿患迟发性听力下降，每年新发耳聋患儿6万～8万名[3]。婴幼儿的语前聋不仅阻碍患儿正常的日常交流，而且还影响其正常的智力发育，已给家庭、社会和国家带来极大的负担，因此，进行非综合征型耳聋（non-syndromichearingloss，NSHL）基因突变检测，对耳聋的预防有重要的意义。目前我国大部分的非综合征型耳聋主要由GJB2、SLC26A4、线粒体DNAl2SrRNA和GJB3这四个基因的突变引起[4,5]，但耳聋基因的突变热点存在明显的种族和地域差异，而明确本地区具体的突变热点对制定有效的预防、干预措施具有重要的指导意义。本研究对粤西肇庆市和云浮市地区部分非综合征耳聋患者进行GJB2、SLC26A4、线粒体DNAl2SrRNA和GJB3这四个基因检测，了解该地区听力障碍患者耳聋流行病学具体情况，为该地区的耳聋防治提供精准的分子病因依据。

1资料与方法

1.1资料

研究对象为广东省肇庆市康复中心非综合征型耳聋幼儿和云浮市特殊教育学校来自于不相关家庭的有听力障碍的学生，共92人，其中女性患者33人，男性患者59人，男女比例为1.79:1；年龄2～20岁，平均9.5岁，汉族。

1.2方法1.2.1病史信息收集

以现场询问(老师或家长)和问卷登记调查为主、电话咨询为辅收集信息，主要包括：家族史、外耳和中耳疾病史、耳聋发病时间、耳聋前后耳毒性药物的使用情况和是否有明确头部外伤史、以及发病时是否伴随其它病症等。建立较详尽的病历档案。所有入选本研究的耳聋患者均经高分辨颞骨CT分析EVA情况和进行听力情况评估。听力水平取平均听阈(0.5、1、2、4KHz的平均值)进行听力分级，参考欧洲标准，听力损伤分为轻度(21~40dBHL)、中度(41~70dBHL)、重度(71~95dBHL)和极重度(95dBHL)。

1.2.2外周抗凝全血采集

统一编号，由专职护士按照采血标准操作流程用乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝采血管抽取受检者前臂外周血2mL，并以医用冰盒送到实验室，于2~8℃冰箱保存血样（三天内提取）。

1.2.3基因组DNA的制备与保存

用QIAampDNAMicroKit提取外周血白细胞DNA，并用GE公司的SimpliNano核酸蛋白测定仪进行DNA的浓度和纯度检测。DNA样本置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4遗传筛查及分析

采用PCR-反向点杂交法（PCR-RDB法）对GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA四个常见耳聋基因共16个热点突变进行检测。其中GJB2基因4个位点：c.35delG、c.-del16、c.delC、c.-delAT；GJB3基因2个位点：c.CT、c.GA；SLC26A4基因8个位点：C.-2AG、c.AG、c.AT、c.GA、c.CT、IVS15+5GA、c.GC、c.TA及12SrRNA基因上2个位点m.CT、m.AG。

对GJB2基因的exon2和12SrRNA基因外显子进行Sanger测序分析；GJB3、SLC26A4基因PCR-RDB检测阳性样本对阳性位点相应片段进行Sanger测序分析。测序工作委托华大基因进行检测。四个基因的参考序列分别为：GJB2：NG-.1；GJB3：NG-.1；SLC26A4：NT_.15；mtDNA：NC-.1。序列分析软件有：Chromas、DNASTAR7.10和DNAMAN8.0。

2检测结果

2.1PCR-RDB（PCR-反向点杂交）法检测结果

92例受检者中，发现4例为GJB2基因突变，突变率为4.35%(4/92)（表1），其中c.delC纯合突变2例，c.delC杂合突变2例。检出9例SLC26A4基因突变，突变率为9.78%(9/92)，其中c.-2AG突变率最高，等位基因频率为5.43%(10/)，其次为c.CT，等位基因频率为1.09%(2/)。其余13个位点未检出突变，在该地区92例非综合征耳聋患者中，总突变率为14.13%(13/92)，偏低，绝大部分患者仍然病因不明，以测序法进一步探究。

2.2测序法检测结果

在两种方法的共同检测范围内，结果是一致的。

2.2.1GJB2基因突变检测结果：92例受检者中，发现33例为GJB2基因突变，其中携带致病突变有18例(包括纯合，复合杂合或显性携带者)(表2)，突变率为19.57%(18/92)。其中c.GA(图2)和c.delC(图1)检出率最高，它们的等位基因频率分别为9.78%(18/)和3.26%(6/)(表3)，占所有GJB2基因致病等位基因数的66.67%(24/36)，是该地区的热点突变。15例只携带了GJB2基因多态突变，该地区的GJB2基因多态突变主要为c.79GA和c.AG两种突变，基因频率分别为11.41%（21/）和7.06%（13/）(表3)。

2.2.2SLC26A4基因突变检测结果：耳聋另一个突变率较高的是SLC26A4基因突变(包括纯合，复合杂合或显性携带者)，共检出9例(表4)，突变率为9.78%(9/92)；其中c.-2AG(图3)突变率最高，等位基因频率为5.43%(10/)(表5)，其次为c.CT，等位基因频率为1.09%(2/)。另外检出两个多态位点突变c.-18TG和C.+GT，它们的基因频率分别为0.54%（1/）和1.09%(2/)。

2.2.3线粒体DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)：未检出l2SrRNAm.AG突变或m.CT突变，但是所有受检者均发生了m.AG位点的均质性多态改变。检出2例罕见的致聋的突变m.AG和m.TC。其中1例m.AG均质性突变(图4)合并GJB2c.delC纯合突变。另外检出1例m.CT(图5)，截止到年9月未见文献报道。

2.2.4GJB3基因突变检测结果：92例受检者中，未检出c.CT或c.GA突变。

2.3听力情况评估结果

92例受检者中，听力损伤均为中度以上（41dBHL）。其中GJB2基因或SLC26A4基因纯合突变或复合杂合突变阳性样本听力均出现重度以上的耳聋（图6）。基因型和临床表型结果一致。

3讨论

耳聋基因突变有明显的种族和地域差异，在不同人种、不同国家的耳聋患者的基因突变的热点及携带频率有明显区别。在中国人群中，影响听力的基因突变主要在GJB2，GJB3，SLC26A4，mtDNA12SrRNA四个基因上[6]。国内学者对不同地区不同人群中进行了上述基因的流行病学研究。孙捷等人[7]报道的新疆地区例非综合征型重度、极重度感音神经性耳聋患者中，GJB2基因突变率7.84%（/），其中汉族10.56%（/）、维吾尔族5.57%（83/），普遍低于全国其他研究报道；SLC26A4基因检出率4.83%（/），汉族、维吾尔族耳聋人群检出率分别9.51%（/）、0.94%（14/）；12SrRNA基因检出率的5.46%（/），汉族、维吾尔族分别为9.67%（/）、1.95%（29/）。王旭东等人[8]报道的厦门地区就诊的耳聋患者GJB2、线粒体DNA12SrRNA和SLC26A4三个基因各自的携带率分别为16.67%、3.03%，12.12%。王栋等人[9]报道的厦门地区新生儿中，热点致病变异中GJB2c.delC的检出率最高，其次是SLC26A4c.-2AG，且杂合型较纯合型多见。本研究的结果跟文献一致，突变主要发生在GJB2和SLC26A4两个基因上，但也有一定的差异。本研究用PCR-RDB法检测时，SLC26A4c.-2AG是该地区检出率最高的位点，GJB2c.delC次之；但是用测序法检测时，发现GJB2c.GA的检出率明显高于SLC26A4c.-2AG和GJB2c.delC。详见下述各个基因的具体分析。

GJB2基因突变是最常见的耳聋基因突变类型，其中c.delC为携带率最高的突变位点，检出率为11.84%[10]。GJB2基因突变通常会导致感音神经性耳聋，表现为在双耳极重度耳聋中检出率最高，单耳聋少见[11]。本研究92例受检者中，33例为GJB2基因突变，其中携带致病突变有18例，(包括纯合，复合杂合或显性携带者)，突变率为19.57%(18/92)，其中c.GA和c.delC等位基因频率分别为9.78%(18/)和3.26%(6/)，占所有GJB2基因致病等位基因数的66.67%(24/36)，是该地区的热点突变。GJB2基因突变率19.57%比全国的均值、王蒙[12]报道的广东地区非综合征型耳聋的中的9.47%、孙捷[7]在新疆地区非综合征型重度、极重度感音神经性耳聋患者中检出的7.84%（/）和段世宏[13]在甘肃省部分非综合征型聋患者检出的11.20%（42/）高，可能主要因为王蒙、孙捷利用晶芯?九项遗传性耳聋芯片试剂盒（微阵列芯片）进行检测的，该试剂盒并未将c.GA纳入检测范围，所以GJB2总突变率偏低。而实际上本研究发现，c.GA在GJB2基因中的等位基因频率高达50%(18/36)，是本地区的突变热点。Huang等人[14]报道在中国海南地区NSHL患者中c.GA的基因频率为15.05%（90/）。另有不同文献报道p.V37I（c.GA）突变在遗传性耳聋患者中具有较高的检出率，约为5%~15%；但因为也有报道称正常人群中存在c.GA纯合或复合杂合突变，认为该位点突变是否为致病性突变仍存争议[15,16]。

而肖毅杰等人[17]认为c.GA突变可能与迟发性耳聋相关，而且之前部分文章可能因为缺乏对该位点的纯合突变患者进行长期的听力随访，或者由于把某些轻度耳聋患者误选入正常群体中，以致假性地提高了正常人群中该突变位点的检出率。不过，随着研究的进一步深入，现已有细胞实验证明，c.GA纯合突变可以影响表达产物缝隙连接蛋白之间的粘连，让其无法形成缝隙连接通道而导致耳聋，而且该位点可能与轻中度耳聋有关[18,19]。因此，个人认为把c.GA纳入耳聋基因检测范围有一定意义。

GJB3基因是我国科学家夏家辉院士首次克隆并明确了若c.CT、c.GA2个位点发生突变会导致常染色体显性遗传非综合征型耳聋的基因，主要会导致显性遗传高频听力下降。满荣军等人[20]在山东省淄博市例非综合征型耳聋患儿检出5例c.CT，其等位基因频率达到1.85%(5/)。刘璟等人[21]耳聋高危人群中发现GJB3基因突变携带率0.55%（2/）。但是在本研究中未检测到这2个位点的突变。

SLC26A4基因是突变率仅次于GJB2的致病基因，临床上可表现为前庭水管扩大（EVA）和耳聋[22,23]，其中c.-2AG是最常见的突变位点，检出率为12.5%[24]。但SLC26A4基因突变具有显著的异质性，该基因的突变类型多样化，且不同种族群体的基因突变图谱均不一样[25]。在北欧LP、TP和IVS8+1GA是突变频率较高的类型；而在东亚c.-2AG和HR是韩国人、中国人和日本人最常见的突变[26]。王蒙等人[12]报道了广东地区c.-2A＞G和c.A＞G突变率分别为9.86%（50/）和2.37%(12/)。王旭东等人[8]报道厦门地区耳聋患者中c.-2AG突变率高达10.6%（14/）。满荣军等人[20]对山东省淄博市例非综合征型耳聋患儿进行耳聋基因检测时发现SLC26A4c.-2AG是最常见的突变，为11.11%(30/)。徐彬等人[27]在安徽汉族遗传性耳聋患儿检出的c.-2AG更高，14.08%（20/）。而本研究发现肇庆、云浮地区c.-2AG突变率为9.78%(9/92)，跟王蒙、王旭东和满荣军报道一致，尽管突变率比徐彬报道的明显低，但是在肇庆、云浮地区其突变率高居第二位，所以不容忽视。而由于SLC26A4基因突变的耳聋患者的发病年龄主要集中在学龄前，通常出生时有较好的听力残余，甚至听力正常，很容易被人忽视。在本研究中有多位患者在1~3岁才出现听力异常的。因此，对SLC26A4基因检测为阳性的患者，可以提示他在日常生活中应避免剧烈运动或者头部受到撞击等环境因素以免引发运动性耳聋，同时还可以给低龄患者做相应的治疗指导方案避免因聋致哑，从而提高患者的生活质量，并减轻家庭和社会的经济负担。

线粒体DNA12SrRNA基因被证明是药物性耳聋相关的责任基因，约有20%-30%的药物性耳聋与该基因相关[28]。目前对mtDNA12SrRNAm.AG突变在我国的流行情况已有较深入的研究。年戴朴等人[29]研究了全国18个不同省份聋校的例NSHL患者中mtDNA12SrRNAm.AG突变，其检出率为2.83%(57/)。纪育斌等[30]对16篇研究对象为非综合征型SNHL患者的文献数据进行了综合分析后，结果显示在我国非综合征型（NSHL）患者中AG突变频率为6.62%(/)。这与段世宏[13]在甘肃省NSHL患者6.13%(23/)的检出率相似。而丁淑琴等人[31]利用博奥公司的耳聋九个位点产品检测皖北地区NSHL患者，发现该地区m.AG等位基因频率高达11.82%（13/）。但本研究并未检出m.AG突变。这有可能因为随着医学知识的宣传和医疗工作人员及大众认识的提高，以及国家对抗生素滥用的干预，减少了氨基糖甙类抗生素的使用，使氨基糖甙类抗生素引起的非综合征型耳聋也随之减少。m.AG突变在听力正常的人群的携带率也更低了。Chang[32]曾对位孕妇进行耳聋基因筛查，仅检出1例（0.2%）携带m.AG突变。而本研究是在近两年开展的，在本研究的92例非综合征型耳聋患者中未检出该位点的突变。

但检出2例Lu[33]报道过的罕见致聋的突变m.AG和m.TC。不过在本研究中因携带m.AG突变的重度耳聋患者同时检出了GJB2c.delC纯合突变，暂不能证明m.AG的表型，而Lu报道的m.AG不够详细，所以m.AG位点突变与耳聋的相关性有待进一步研究。另外，检出1例m.CT，截止到年9月未见文献报道，该位点是否跟耳聋的有关需要进一步研究。

综上所述，我国人口众多，民族成分复杂，而耳聋基因突变具有明显的种族差异和区域差异，所以区域性耳聋基因筛查对本地区的耳聋基因热点突变情况的了解及其遗传咨询和疾病防控具有十分重要的意义。本研究立足于粤西肇庆、云浮地区针对聋病患儿进行四个常见致聋基因多个热点突变位点检测，尽管有一定的地域局限性和检测突变位点数量的局限性，检测例数约例，但也基本反映了该地区非综合征型耳聋患者基因突变的流行情况。本研究结果表明在该地区耳聋患者中具有较高的检出率，其中GJB2基因c.GA突变率高达16.30%（15/92）。建议将包括c.GA、c.delC、c.-2A＞G等位点的遗传性医院新生儿的听力筛查项目中，为本地区大范围耳聋基因筛查、临床诊断和耳聋进一步的分子研究提供重要的原始数据，为患者的早发现早治疗和降低该地区耳聋的发生提供有力保障。

致谢：感谢肇庆市康复中心和云浮市特殊教育学校的教职员工和各位学生家长对本课题研究的大力支持和帮助。

扫描或长按下方

转载请注明：http://www.wodedaogou.net/hzelyy/5640.html