文献精选丨拯救ldquo贝多芬r

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科研工具丨作图丨实验丨SCI丨统计分析丨国自然

哈佛医医院的科学家们使用了一种新的基因编辑方法来挽救遗传性听力损失的小鼠的听力，并成功地做到了这一点，而治疗没有任何明显的偏离目标的效果。

这些被称为贝多芬老鼠的动物，接受了同样的基因突变治疗，这种突变会导致人类逐渐丧失听力，到20多岁时，最终导致严重的耳聋。

7月3日《自然医学》（《NatureMedicine》）在线报道了这一新方法，包括一个优化的、更精确的经典CRISPR-CAS9基因编辑系统，该系统能更好地识别贝多芬小鼠的致病突变。这种改进的工具使科学家们能够选择性地禁用一种叫做TMC1的听力基因的缺陷拷贝，同时保留健康拷贝。

值得注意的是，研究人员报告说，他们的系统成功地识别出了老鼠基因组中30亿个DNA信息中的一个错误的DNA信息。

研究人员警告说，在这种高精度的基因编辑疗法应用于人类之前，还有更多的工作要做。然而，他们说，这项工作是一个里程碑，因为它大大提高了标准基因编辑技术的有效性和安全性。

“我们的研究结果表明，这种更精致、更具针对性的CRISPR/CAS9编辑工具实现了前所未有的识别和准确度，”哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所的贝塔雷利转化医学教授DavidCorey副研究员说。

此外，研究小组说，研究结果为使用同样精确的方法治疗由单一基因缺陷引起的其他显性遗传性疾病奠定了基础。

每个人都继承了同一基因的两个拷贝——分别来自父母。在许多情况下，一个正常的基因足以保证正常的功能，从而使个体免于疾病。相比之下，在所谓的显性遗传性遗传疾病中，单一的缺陷拷贝会导致疾病。

“我们相信我们的研究为超靶向治疗一系列基因缺陷引起的遗传性疾病打开了大门，”哈佛医院耳鼻喉科和神经学教授、医院F.M.Kirby神经生物学中心的副研究员JeffreyHolt说：“这确实是一种精确的医学。”

携带有错误的TMC1基因的老鼠被称为贝多芬老鼠，因为它们的病程类似于著名作曲家所经历的渐进性听力损失。然而，LudwigvanBeethoven耳聋的原因仍然是一个猜测。

在小鼠身上，贝多芬缺陷的标志是TMC1基因的DNA序列中有一个错误的碱基——A而不是T——这是一个单一的错误，导致了正常听力和耳聋之间的区别。

使TMC1基因的突变拷贝失活或沉默足以保护动物的听力，但如何在不无意中也使健康基因失活的情况下做到这一点呢？

两把钥匙总比一把好

经典的CRISPR-CAS9基因编辑系统是通过一个引导分子GRNA来识别目标突变的DNA序列。一旦目标DNA被精确定位，切割酶——CAS9——就会将其剪断。

到目前为止，这些基因编辑的准确性还不够完美。这是因为引导CAS9酶到达目标位置的指导RNA和切割目标DNA的CAS9酶并不完全准确，最终可能会切割错误的DNA。

为了规避这些挑战，研究者们采用了一种最初由HMS病理学教授KeithJoung医院HMS病理学助理教授BenKleinstiver开发的工具，该工具使用了一种来自金黄色葡萄球菌的改性CAS9酶，而不是T。他标准的CAS9源于化脓性链球菌。

为了提高检测和破坏的准确度，新的优化系统结合了两种识别水平——GRNA定位目标基因和一种可精确定位贝多芬小鼠特定DNA突变的改良型CAS9。使用两种形式的鉴定可以确保对该基因的异常拷贝进行精确和选择性的切割，而且只对异常拷贝进行切割。

研究的第一作者BenceGyorgy说：“我们利用了这个系统识别突变DNA而不是正常DNA的事实，并使用了双重识别系统来提高精度。”他在哈佛医学院进行了这项研究，现在在瑞士巴塞尔分子与临床眼科研究所。“这种方法在针对突变基因方面产生了前所未有的特异性。”

在对有或没有贝多芬突变的细胞进行的一组初始实验中，该工具准确地区分了TMC1基因拷贝中的突变DNA和正常DNA。进一步的分析表明，在贝多芬细胞中，含有一个缺陷基因和一个正常基因拷贝的细胞，至少99%的分子“切割”只发生在缺陷基因拷贝中。

接下来，研究人员将基因编辑疗法注射到有或没有贝多芬突变的小鼠的内耳中。DNA分析表明，只有贝多芬缺陷小鼠的内耳细胞才有编辑活性。在没有突变的老鼠的内耳细胞中没有检测到编辑变化，这一发现证实了该工具的精确性。

为了确定基因编辑疗法是否干扰了正常的基因功能，科学家们从没有携带贝多芬缺陷的老鼠的内耳中刺激了被称为毛细胞的听觉细胞。细胞无变化，听力反应正常，证实基因编辑治疗对正常基因功能无影响。

使贝多芬沉默

为了测量这种疗法是否对动物有效，而不仅仅是对细胞有效，研究人员进行了金标准听力测试。他们测量了动物的听觉脑干反应，这些反应捕捉到内耳毛细胞检测到的声音有多少，然后传到大脑。

如果没有治疗，贝多芬小鼠通常在6个月大时完全失聪。相比之下，没有遗传缺陷的老鼠在一生中都能保持正常的听力，并能检测到30分贝左右的声音——这一水平与耳语相似。

接受基因编辑治疗两个月后，贝多芬小鼠的听力明显优于未经处理的携带基因突变的兄弟姐妹。经过处理的动物能够检测到45分贝左右的声音——正常对话的音量——或者比未经处理的老鼠安静16倍。贝多芬鼠的听力保存最为完好，能听到25到30分贝的声音，几乎与健康的同类老鼠没有区别。

综上所述，研究结果表明，新的基因疗法有效地抑制了基因的缺陷拷贝，挽救了动物在疾病中常见的快速失去的听力。

由于该病以渐进性听力损失为特征，研究人员评估了几个月来治疗对进展的影响。研究人员在出生后不久对有或无突变的经过治疗和未经治疗的小鼠进行治疗，并在长达6个月的时间内每四周测试一次其听力水平。在第一个月，未经处理的贝多芬小鼠可以听到低频声音，但在高频时有明显的听力损失。到出生后第六个月，未经治疗的贝多芬老鼠已经失去了全部听力。相比之下，经过处理的贝多芬小鼠在低频时仍保持在正常听力附近，有些甚至在高频时也表现出接近正常听力。

值得注意的是，没有携带遗传缺陷的受治疗动物没有因基因治疗而遭受任何听力损失——这一发现证明了手术的安全性，以及选择性地针对基因异常拷贝的能力。更令人鼓舞的是，一小部分接受贝多芬治疗的老鼠在接受了将近一年的跟踪治疗后仍保持着稳定、接近正常的听力。

由于贝多芬的缺陷表现为内耳听力细胞的逐渐恶化和死亡，研究人员使用电子显微镜来观察这些关键听力细胞的结构。正如所料，在未经处理的贝多芬小鼠中，研究人员发现随着其结构的恶化，听力细胞逐渐丧失。相比之下，经过处理的贝多芬小鼠和经过处理的健康小鼠都保留了正常数量的听力细胞，结构完整或接近完整。

在最后一个实验中，科学家们在一系列携带贝多芬突变的人类细胞中测试了这种治疗的效果。DNA分析表明，治疗只导致了TMC1基因突变拷贝的编辑，而不影响正常基因的编辑。

由于它能够针对单点基因突变，该方法有希望获得15种其他形式的遗传性耳聋，这些耳聋也是由其他听觉基因的DNA序列中的一个单碱基突变引起的。

此外，研究小组说，他们的技术可以用于其他由单点突变引起的显性遗传性疾病。为了确定它的假设效用，科学家们扫描了联邦克林瓦尔数据库——一个与人类疾病有关的所有已知基因突变的国家数据库。分析表明，基于该工具的特异性，可以正确识别出个缺陷基因变异体，这些缺陷基因变异体共同负责五分之一的显性人类基因突变。

“可以肯定的是，这是长途旅行的第一步，”Holt说。但我们在这里所得到的是原理的证明，证明这种高度特异性、高度靶向性的治疗可以发展成选择性地沉默携带单点突变的基因，并可能治疗许多其他形式的人类疾病。”

参考文献：BenceGy?rgy,CarlNist-Lund,BifengPan,YukakoAsai,K.DomenicaKaravitaki,BenjaminP.Kleinstiver,SaraP.Garcia,Miko?ajP.Zaborowski,PaolaSolanes,SofiaSpataro,BernardL.Schneider,J.KeithJoung,Gwena?lleS.G.Géléoc,JeffreyR.Holt,DavidP.Corey.Allele-specificgeneeditingpreventsdeafnessinamodelofdominantprogressivehearingloss.NatureMedicine,;DOI:10./s---9（IF=30.）

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